A pisai születésű Galileit a természettudományos kérdések izgatták, de apja kívánságára a pisai egyetem orvosi karára iratkozott be. A zenében is kitűnt, ragyogóan játszott lanton, írói vénával is rendelkezett, ugyanakkor türelmetlen és összeférhetetlen, éles nyelvű ember volt, aki könnyen szerzett magának ellenségeket. A legenda szerint még egyetemistaként egy misén a mennyezetről lógó csillárt nézve vette észre, hogy annak lengésideje ugyanakkora maradt, akár nagyot, akár kicsit tért ki. Hazatérve kísérletezni kezdett és megállapította, hogy kis kitérésnél a lengés nem függ a kitérés amplitúdójától, csak az inga hosszától. Apja ezután megengedte, hogy a matematikai fakultásra iratkozzon át.
Galilei volt az első, aki a kísérleteket és a matematikai elemzéseket együtt alkalmazta, "Isten nem kívánhatja, hogy lemondjunk érzékszerveink és értelmünk használatáról a természet közvetlenül tapasztalt dolgaiban" - írta.
1589-ben megcáfolta Arisztotelész tételét a különböző súlyú testek esésének különböző sebességéről. Az elterjedt legenda szerint a pisai ferde torony tetejéről ejtett le két ágyúgolyót, és hiába volt az egyik tízszer nehezebb, egyszerre értek földet - a valóságban azonban egy ferde lejtőn gurított le különböző súlyú tárgyakat.
Arra is rájött, hogy a gyorsulás az idő négyzetével arányos, és hogy a testek megőrzik sebességüket, amíg egy másik erő nem hat rájuk. Azt is bizonyította, hogy egy testre egy időben két erő is hathat, megmagyarázva a kilőtt ágyúgolyók parabola pályáját.
Miután tudomást szerzett a holland Hans Lippershey távcsövéről, ő is készített egyet, ennek nagyítása azonban már harminckétszeres volt. Eszközével megfigyelte a Hold hegyeit, megállapította, hogy a Tejutat csillagok sokasága alkotja, felfedezte a Jupiter négy holdját, a Szaturnusz gyűrűit, a Vénusz fázisait és a napfoltokat.
Tapasztalatai végképp meggyőzték a heliocentrikus világkép igazáról, először 1612-ben foglalt nyilvánosan állást Arisztotelész ellen. Egy évvel később a napfoltokról írt dolgozatában Kopernikusz igaza mellett foglalt állást, majd egy könyvet írt a Biblia értelmezéséről, amellett érvelve, hogy a heliocentrikus világkép nem ellentétes az Írással, ha annak passzusait nem szó szerint értelmezzük. Ellenségei "istentelennek" bélyegezték és feljelentették az inkvizíciónál, ezután 1616-ban V. Piusz pápa "hamisnak és tévelygőnek" nevezte Kopernikusz tanait, Galileinek pedig előírták, hogy tanait csak matematikai feltevésként kutathatja.
Galilei ezután Firenze melletti házában dolgozott, a határozat visszavonását nem sikerült kiharcolnia. Csak annyit sikerült elérnie, hogy 1632-ben kiadhassa Párbeszédek című, a két világrendszert elemező művét. A könyv hatalmas siker lett, még kínaira is lefordították, de a jezsuiták kimutatták, hogy Galilei a semleges címe ellenére a kopernikuszi elveket hirdeti. A pápa különösen zokon vette, hogy sokan vele azonosították a Ptolemaioszt védő, ostoba karaktert és eljárást rendelt el. (Mivel a könyv cenzori engedéllyel jelent meg, arra hivatkoztak, hogy a tudós nem tartotta be az 1616-os határozatot, amely eltiltotta a kopernikuszi tanok terjesztésétől.)
Az inkvizíció 1633. június 21-én bűnösnek találta Galileit, akit életfogytiglani börtönre, nézetei visszavonására ítéltek és az írástól is eltiltották. A csaknem hetvenéves tudós elfogadta sorsát, az ellenállástól visszariaszthatta a megégetett Giordano Bruno példája, s nyilvánosan "megtagadta, elátkozta és megvetette" korábbi hibáit. Az megint csak legenda, hogy térdeiről felemelkedve azt suttogta: Eppur si mouve - azaz És mégis mozog (a Föld), a szállóigét először száz évvel később írták le.
Büntetését a pápa házi őrizetre változtatta, itt írta meg tudományos testamentumát, a Matematikai érveléseket, amelyben lefektette a mozgástan és az anyagmechanika alapjait. A könyv 1638-ban, Hollandiában jelent meg, hogy kijátssza az inkvizíció cenzúráját. Galilei élete végén megvakult és megsüketült, de szelleme élénk maradt.
1642. január 8-án, hetvenhét évesen halt meg. A toscanai nagyherceg a tudós végakaratához híven a firenzei Santa Croce-templomban akarta eltemetni, de az egyház csak 1737-ben engedélyezte, hogy csontjait ide vigyék és sírját méltóképpen megjelöljék. Pere, amely voltaképpen a tudományos kutatás és a dogmák közt zajlott, csak 359 év múlva, 1992-ben ért véget, amikor II. János Pál pápa a Vatikánban elmondott beszédében rehabilitálta, zseniális fizikusnak és igaz hívőnek nevezte Galileit.